電子 顕微鏡 染色法

キーワード:電子顕微鏡法,分子標識,可視化,金属結合タンパ ク質,遺伝子組み換え 0 WO\j) ÿ y>VãlÕNº eåg, U_® á[fO 0 最近の研究と技術 電子顕微鏡法のための細胞内分子標識法の開発 73 ころ,MT の数が増えるほど,MT1 分子内のCd 含有率が減 少することが分かった.これらは,MT の分子数 … All rights reserved. 2 (2017) 1. 一般に培養した細胞は基質の上に一層で繁殖するため垂直方向には数ミクロンの厚さしかない。したがって、細胞を水平に切り、広く観察しようとするのはかなり難しい。トリミングに失敗すると試料を失う。また、カバーガラスなどに培養した場合、樹脂に包埋したのち細胞を樹脂側に残し、如何にしてガラスを剥がすかも悩むところである。最近ではそのままトリミングできたり、また容易に樹脂から剥がせたりする軟性の培養用プラスチック製カバーガラスも発売されている。神経の一次培養などのようなデリケートな細胞培養には向かないかもしれないが、概ね良好である。 All rights reserved. incCopy(); 染色後は再び(図19)のように蒸留水を満たしたビーカーに次々とdippingして洗浄する。洗浄後は乾燥させ電子顕微鏡で観察する。超薄切片法の応用例として、カエル縫工筋の超薄切片の透過電子顕微鏡写真を(図21)として掲げる。, そのむかし、ダイヤモンドナイフは高級品のイメージが強く、多くの形態学者は超薄切片もガラスナイフで切っていた。しかし、研究のスピードが高まるにつれ、ナイフマークもでず、切れ味が良く、繰り返し何回でも使用できるダイヤモンドナイフは必需品となっていった。今や超薄切片を切るのにダイヤモンドナイフを使用しない人は皆無であろう。semi-thin sectionまでもダイヤモンドナイフを使用する時代となった。 電子顕微鏡のコントラストは主に電子線の散乱により形成されるので(amplitude contrast)、散乱が起こらないと像が観察されないことになる。また、蛋白質分子のように試料が小さいとピントをずらすことによる位相差像もぼけの中に埋没してしまい期待できない。合わせて、真空中で観察しなければならないことおよび電子線による照射ダメージを考えると精製蛋白質をそのままグリッドに載せ観察することは不可能に近い。したがって、簡単に見るためには染色剤で分子の周りを固めたり(ネガティブ染色)、白金蒸着したりして観察することになる(低角度回転蒸着法:low angle shadowing)。 Place each grid into well of a round bottom ceramic tray filled with 5ml 1, 2-dichloromethane. 実体顕微鏡で見ながら、ヤスリ、カミソリ刃を使用してトリミングをするので、ワーキングディスタンスの長い実体顕微鏡を購入すると良い。 (図2)のようなトリミング専用のコーナーを造り、道具を並べておくと便利である。薄切を容易にするには(図1)のように試料の一部を上面が0.5mm×0.5mm程度のきれいなピラミッドに削り出す。特に削りだしたピラミッド上面と側面の角度は120度ぐらいで、丸みを帯びずにシャープな方が薄切には適している(図3参照)。, トリミング後、試料ブロックをウルトラミクロトームに装着する。(図4)はLEICA社製ミクロトームに試料を装着した写真である。超薄切片をいきなり切るのではなく、まずトリミングした面を平らにし、1ミクロン厚程度の切片(準超薄切片:semi-thin section)を切り、光学顕微鏡で観察し、目的とする組織細胞が表面に露出されているか確認する。そののち超薄切片を作製する。表面出しや試料組織の確認のためのsemi-thin section の作製には通常ガラスナイフを使用する。 一般にガラスナイフではボートとよばれる水受けを装着し、そこに水を張り、切片を水面上に展開して回収する。しかし、荒削りや確認用の準超薄切片の作製には必ずしもこのボートをつける必要はない。荒削りの時点で重要なことは左右の角度、仰角をともにゼロとして始めることである(便宜的に我々はゼロ-ゼロと呼んでいる)。試料面が平らになったら、後述のように1µm前後の切片を作り試料の向きなどを確認する。必要に応じ左右の角度を変え目的とする方向の切削面を露出させる。 これまでの経験では、ここに紹介しているように、平板包埋し切り出して方向性を考えて台に接着した場合には、ほとんど角度を変える必要はなかった。特に仰角を変えることはなかった。ナイフを交換するとき、あるいは後日切片作製を続ける時には再度面合わせをしなければならないが、この時角度がほぼゼロ-ゼロであると大変便利である。, ナイフを交換した時、後日同一面から再び切片を作製しようとする時、試料面とナイフ面を再度一致させる「面合わせ」という作業が必要である。また、厚みのない培養細胞から水平方向の切片を得ようとする場合は最初から正確な面合わせが必要である。 (図14)のようにガラスナイフをダイヤモンドナイフに変え、ボートに純水を満たし、再度試料ブロックと慎重に面あわせをおこない、薄切を開始する。薄切速度は通常1mm/secである。最初の2~3枚は200~300nmの厚切りで、試料全面が薄切できるようになってから、70nmの超薄切片を切る。切片の厚さは反射干渉色でわかる。銀色の切片は70nm、金色の切片は90nm、グレーは50nmである。水位が適当であるとこの干渉色が明瞭になるだけでなく、切片も刃先にとどまらず、水の表面を次々と手前に滑りリボンを形成する(図14)。, ダイヤモンドナイフのボートに水を満たすときは5mL程度の針付き注射器を用いる。はじめ表面張力で盛り上がるほど蒸留水を注ぎ、刃先まで水がなじむようにする。約30秒後、こんどは注射器で水を吸い込み、水面が僅かにへこむようにする。この時水面は反射して透明度が下がり少し白色がかる。また、水が刃先まで達していることを確認する。ダイヤモンドはもともと疎水性が強いので、ちょっとした汚れでも水をはじいてしまうことがあるので注意する。どうしても水のりが悪いときはミクロトームからはずし、70%エタノールで洗浄したのち使用する。, 水面に浮いている超薄切片はeyelash toolと呼ばれる道具で寄せ集め、4~5枚の集合を作る。(eyelash toolは直径2mm長さ10cm程度の棒の先端に睫毛を一本付けただけの簡単な道具であり自作する。) 通常、酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色をしたのちに観察する。染色はパラフィルムの上で(図18)のように行う。5分間ウラン染色をおこない(図19)のように最初50%エタノールで洗浄後、さらに蒸留水で洗浄し、鉛染色液に移す。鉛染色の時間は1分である。 Rinse twice with 1, 2-dichloromethane and then air-dry. (3) 参考文献. 98 顕微鏡 Vol. 単粒子解析などの画像処理法と組み合わせると数ナノメートルの分解能で立体像を予測できる。カーボン支持膜などを張ったグリッド(メッシュ)に試料を吸着させ、酢酸ウラン、燐タングステン酸などの染色剤をのせる。余剰の染色剤を濾紙で吸い取り、乾燥と同時に試料の周りを染色剤で固める方法である。 低温電子顕微鏡法(ていおんでんしけんびきょうほう、Cryo-electron microscopy、cryo-EM、クライオ電子顕微鏡法)は透過型電子顕微鏡法の一種で、試料を低温(多くの場合液体窒素の温度)において解析する手法である 。 構造生物学や細胞生物学の分野において用いられる 。 光学顕微鏡は自然光あるいはハロゲンラン プなどを使用するので理論分解能は0.2μm程度, 実用的な倍率は1,000倍程度である. Leave it for 30 min Transfer a grid into next well of a round bottom ceramic tray filled with 5ml 1, 2-dichloromethane 5min. また、試料の物性により部分的にポジティブ染色が加わることもある。分解能が高いだけ構造解析は慎重に行うべきである。図4に応用例として微小管の染色像を掲げる。. 表面抵抗率・体積抵抗率 絶縁破壊試験 帯電性(ロータリースタティック法 ) 帯電性(オネストメーター法) 比誘電率・誘電正接(自動平衡ブリッジ法) 比誘電率・誘電正接(円筒空胴共振器法) 比誘電率・誘電正接 ミリ波帯(平衡型円板共振器法) 比誘電率・誘電正接 ミリ波帯(遮断導� 走査電子顕微鏡法(3) 木村利昭 (Toshiaki Kimura) iii)導 電染色法 本法は非導電性の試料ブロック全体に導電性を付与 する方法である。大別すると液相法と気相法があり, 液相法には試料と染色液を直接化学反 … 2001, © Hitachi High-Tech Corporation. 面合わせは初心者にとって多少難しいところであるが、避けて通れないので練習により習得する必要がある。, ガラスナイフは市販のナイフ用ガラス板をナイフメーカーで割断し作製される。 2 クライオ電子顕微鏡法の原理 タンパク質のような生体試料は,一般的に水を媒介と してその形状や機能を維持している.一方,電子顕微鏡 の内部は電子を飛行させるために高い真空度(< 10−5 Pa) に保たれている.よって,生体試料をそのまま電子顕微 このウェブサイトでは、JavaScriptの機能を有効に設定していただくことで、最適なコンテンツをご覧いただけます。, 電子顕微鏡というイメージからすると分子を見ることは何でもないように思えるが、実際は難しい。確かに分解能的には十分であるが、蛋白質をはじめ生体を形成する分子は全て軽元素から構成されており、電子線を十分散乱させることができない。 透過電子顕微鏡用試料作製法と問題点 (非生物試料編) 1.透過電子顕微鏡TEM用試料の特徴 (1)加速電圧と試料の厚さ(透過能) (2)tem 用試料に必要な条件 2.観察目的とtem 用試料 3.形態観察-レプリカ法 4.粉体・微粒子観察法 このウェブサイトでは、JavaScriptの機能を有効に設定していただくことで、最適なコンテンツをご覧いただけます。, 平板に包埋した試料をトリミング、薄切するには(図1)に書かれているように、平板から一度試料を切り出し、方向を考えた上で円筒形の台に接着しなければならない。接着には瞬間接着剤を用いる。また、円筒形の台は包埋の際に余った樹脂をカプセルに流し込み作製しておく。最初から円筒形のビームカプセルに包埋した方がはやいように見えるが、急がば回れで、試料組織の方向を決めて切片を作ることを考えるとこちらの方が便利である。 宮崎大学医学部解剖学講座 超微形態科学分野 Department of Anatomy, Ultrastructural Cell Biology Faculty of Medicine, University of Miyazaki. 試料ブロックをミクロトームに装着し、ダイヤモンドナイフを取り付ける。目分量で試料面と刃先の間を2mmぐらいまで近づける。手動でゆっくりと試料ブロックを上下させ、改めて試料とナイフとの位置関係を確認する。, ミクロトームのビノキュラーを覗きながら、左手でナイフ粗動送りノブを少しずつ回転させ、ナイフを試料ブロック手前0.1m位まで近づける。, ナイフと試料面との間が0.1mm位まで近づくと試料面に黒いナイフの影を明瞭に認めることができるようになる(ただし斜め手前からの蛍光灯の照明がある時のみ)。, 試料面と刃先が平行であればこの影または明るい帯は長方形となる。もし左右どちらかが広い場合は広いほうにナイフを振り、長方形とする。また、試料ブロックを上下させた時、この刃先の影または明るい帯の幅が同一であれば試料面の全面に渡って刃先との間隔が一定であることを示している。すなわち仰角が合っていることを示している。, 以上の調節をし、試料の上下運動に対し刃先の影あるいは明るい帯の形が長方形でその幅が一定になれば試料面とナイフの間隔が一定であり、面合わせが終了したことになる。, Cell Culture Coverslip, Thermanox plasticは消毒済であるが、一方の表面だけが細胞接着性を高めてある(いわゆるtreated状態)。そのため方向性を確かめて培地に入れる(図22)。イオンスパッタにより親水化しておけばどちらの面にでも細胞は接着する。, Coverslipの8割方が細胞で埋め尽くされるようになったら、固定する。固定、脱水、包埋の途中までは前述の組織細胞と同様に行う。しかし、培養細胞は一層であるので長く固定する必要はなく、前固定30分、後固定15分で十分である。脱水も各ステップ5分でいい。しかし、最後の樹脂への置換(プロピレンオキサイド/樹脂1:1の混合液)は一晩おいたほうが無難である。, ビームカプセルの上面に盛り上がるように樹脂を注入し、真空デシケーターで脱気し、気泡を上面に集める。この気泡をピンセットですくい取る。つづいてCoverslipの細胞面を下向きしてビームカプセルの上に置く(図23)。この状態でオーブンに入れ硬化させる。, Coverslipはビームカプセル径よりも大きいので帽子のつばのようにはみ出す。硬化後この部分をつまみカプセルより剥がす。細胞はカプセル側の表面に残るので、表面を傷つけずに周囲を切り落としトリミングする。トリミング後は前述のように超薄切片をつくる。ただし、表面直下に細胞が並んでいるだけなのでナイフの面合わせは慎重におこなう。. 1.はじめに 弾性線維を透過型電子顕微鏡(以下電顕と略 す)で観察する為には,酢酸ウラニールおよび 鉛塩による一般的な切片染色法1)では十分なコ ントラストが得られない事は良く知られている。 にネガティブ染色法やイオン液体を用いての金属錯 1.はじめに 電子顕微鏡室の研究支援業務紹介 医学研究支援部門 形態系 電子顕微鏡室では臨床 検査技師および電子顕微鏡技術認定試験一級技士資 格保有の担当者が主に電子顕微鏡を用いた超微形態 incCopy(); 法などの伝統的な観察方法が多い傾向にある。そこで本研究では、食品分野で の活用例がほとんどないクライオ電子顕微鏡法に着目した乳および乳製品の微 細構造解析を行った。クライオ電子顕微鏡法とは、クライオステージやクライ 顕微鏡(染色)のメーカーや取扱い企業、製品情報をまとめています。イプロスは、ものづくり・都市まちづくり・医薬食品技術における情報を集めた国内最大級の技術データベースサイトです。 Repeat this step 4 times. 試料より周囲の染色剤の方が電子線を散乱するで、試料は白く浮かび上がる。すぐに観察でき分解能の高い像を得ることができるが、自然乾燥であること、染色剤の被覆の相違により像が変化することなどを考慮し、像の解釈には十分注意する必要がある。, フォルムバールの支持膜を張っただけのグリッドでもネガティブ染色に使用できるが(応用例はフォルムバール支持膜上で観察したものである)、小さい分子の高分解能ネガティブ染色には平らなカーボン支持膜を張ったグリッドが必要である。マイカを剥離し新鮮な面を露出させ、その面にカーボンを厚め(20nm)に蒸着する。水面上にカーボン膜を浮かせ、その上にグリッドを載せ切片用の支持膜と同様に紙を上から被せ回収する(図1)。一枚一枚グリッドでカーボン膜をすくって膜を張ってもいい。カーボン膜は疎水性が強いのでイオンスパッタ装置にて親水化する。, 染色法は変化に富んでおり、取り扱う試料により多少異なるようであるが基本的には同じと考えていい。ここでは酢酸ウランによる染色法を解説する。, ネガティブ染色では分子の輪郭が観察されるのであり、染色剤が中にしみ込まない限り内部は見えないはずであるが(図3)、染色剤と試料との関係は様々で、それにより見え方も多少異なる。 現場で実際に役に立つよう詳細に解説したマニュアル。〔内容〕試料作製法/超薄切片法/電子染色/支持膜と真空蒸着/凍結技法/組織化学/オートラジオグラフィー/写真処理/透過・走査電顕の原理と構造/分析電顕/画像処理/他 2001, 我々はこの方法を一般のガラスではなくサファイアガラスと組み合わせ、急速凍結、凍結置換法に用いている。したがって、後者の方法は凍結置換法のところで詳述するが、通常の超薄切片法にも応用できるので参照して欲しい。, プラスチックカバーガラス(Nalge Nunc International 社のCell Culture Coverslip, Thermanox plasticの直径13mmのものを推奨する。Cat# 174950)、細胞培養システム一式(細胞培養の項目参照)、樹脂包埋用ビー厶カプセル、固定液、脱水用アルコール、プロピレンオキサイド、包埋用エポキシ樹脂(前述の固定、脱水、溶剤置換を参照). 電子顕微鏡による観察は通常の組織を観察する方法と本質的に変わりませんが、対象とするバクテリアの形態観察はウイルスと同様ネガテイブ染色法、シャドウ法、超薄切片法を利用して透過型電子顕微鏡 ( tem ) 観察する場合と凍結乾燥後に走査型電子顕微鏡 ( sem ) 観察する場合があります。 52, No. 透過型電子顕微鏡 試料作製法 Sample Preparation for TEM Observation. 第3節 電子顕微鏡 3.1 はじめに 顕微鏡の分解能は使用する光源の波長によって決まる. © Hitachi High-Tech Corporation. 日立ハイテクより、「構造細胞生物学のための電子顕微鏡技術」「8.単離した分子を見る(1)」、ネガティブ染色(negative staining、負染色)について公開します。 染色後は再び(図19)のように蒸留水を満たしたビーカーに次々とdippingして洗浄する。洗浄後は乾燥させ電子顕微鏡で観察する。超薄切片法の応用例として、カエル縫工筋の超薄切片の透過電子顕微鏡写真を(図21)として掲げる。 電子染色液の作り方: (図7)に示すLKB型のナイフメーカーでは専用の25mm×400mm(6mm厚)の細長いガラス板を用いる。このガラスの両長辺はすでに極めて平らな鏡面仕上げになっており、簡単にしかも一度に二つのナイフが出来るのが特徴である。一方、(図8)に示すような旧三慶(株)のナイフメーカーでは10cm×10cm(6mm厚)のガラス板を用いてナイフを作る。この機械ではまずナイフの刃となるべき、鏡面仕上げの割面を自分で作る必要があり、2回ほど多く割断の手間がかかる。, しかし、40年ほど前までガラスカッターとプライヤーを用いてナイフを作製していたことに比べれば、極めて質の良いナイフが容易にできる。現在ではこの型のナイフメーカーを使用している研究者は少なくなっていると思われる。我々はLKB型のナイフメーカーを所有しているものの、旧三慶のナイフメーカーで使用するガラスの方が経済的なので使用している。その作製の手順を(図9)に示した。最近ではガラスカッターとプライヤーはほとんど必要ではないが、この型のナイフメーカーを使用するときはナイフの高さを20mmにして、それより下を切り離すのに必要である。, ガラスナイフに切片を浮かせるための水ボートを付けず、乾燥のまま1ミクロン程度の切片を切る(図10)。切片は多少カールしながらナイフエッジに付着するので、これらを先の尖ったピンセットでつまみ、スライドガラス上の水滴の上に落とす。スライドガラスを80℃のホットプレートの上に載せ水分を蒸発させて、切片をガラス上に固着させる。カールしている切片もこの過程で伸展することが多いが、仮に折れ曲がっていても試料の状態を確認するだけであるから問題はない。, つづいて0.5%トルイジンブルー溶液を載せ、20秒間熱し、流水で染色剤を洗い流し(図11)、再び乾燥してから光学顕微鏡で観察する。切片を作ろうとしている部分の組織中でのおおよそのオリエンテーションがわかるはずである。, トルイジンブルー染色液の作り方蒸留水100mLに朋砂(Borax; Sodium tetra-borate)0.5gを混ぜて溶解し、その後トルイジンブルー0.5gを完全に溶解し、使用液とする。, さらにトリミングが必要と判断されたときは試料ブロックをミクロトームからはずし、再びカミソリで余計な部分を削除する。これ以上トリミングの必要がないときはナイフをガラスからダイヤモンドナイフに変えて超薄切片製作に移る。光学顕微鏡用の正確なプレパラートを作製する場合はガラスナイフにボートを付け(なお、ビニールテープによる水ボートの作り方は(図12)に概説するが、ダイヤモンドヒストナイフの使用を推奨する)、切片を水に浮かせたのちガラス棒または白金ループを使い、スライドガラス上の水滴に移動させる(図13)。, トリミング、荒削りが終了し、目的の組織細胞が露出されていることが確認できたら、超薄切片作製に移る。 (2) 低角度回転蒸着法 (low angle rotary shadowing), 試料溶液を膜張グリッド上に載せ、10分間程度静置し、試料分子を膜面に吸着させる。図2のようにグリッド上に試料滴を盛る方法とパラフィルム上に試料滴を作り、そこにグリッドを被せる方法の2通りがある。, パラフィルム上に2%酢酸ウラニウム水滴を2つ用意し、試料側が水滴に接するように被せる。2つの酢酸ウラニウム水滴にそれぞれ1秒位づつ接触させる。. ここではプラスチックカバーガラス上に培養した細胞の包埋法を解説する。一方、カバーガラスにカーボンを蒸着し、その上に細胞を培養するという優れた方法もある。樹脂包埋後トリミング時にガラスを剥ぐとカーボン膜との間で剥がれる。勿論細胞は樹脂側に付くし、黒いカーボン膜が細胞の場所の目印になる。細胞の基質への接着点も正確に観察できる。 走査電子顕微鏡は、表面観察・分析用の豊富な付属装置や付属機器との結合により、その利用範囲を大幅に広げ、世界中の研究開発機関や品質検査の現場で、最も活躍する装置の1つとして使用されています。 電子を利用してミクロの世界を観察. 透過型電子顕微鏡(TEM)の試料作製法. (図15)のようにこの切片集団にグリッド(メッシュ)を上から被せるようにして切片を吸着させる。エポキシ系の切片の場合は何も処理していないグリッドでも拾うことが出来るが、我々は切片以外の用途にも使用できるように常にフォルムバールの支持膜を張ったグリッドを用意している。フォルムバール膜をグリッドに張るには1%フォルムバール/クロロフォルム溶液を作製し、これを(図16)のような市販の膜作製装置にいれ、均一な厚さの膜をスライドガラス上につくり、これを(図17)のように水面上に展開して作製する。, オスミウム酸により後固定された試料は、電子線に対しある程度コントラストを持つが不十分である。 染色法、樹脂包埋は用いず生物試料の凍結超薄切片上で 抗原抗体反応を行う凍結超薄切片法(無包埋免疫染色法) などがある1)。 近年、形態学領域で光電子相関顕微鏡(clem)法とい う新たな顕微鏡観察手法が考案され注目を浴びている2)。 ここでは、当センターで日常的に使用している試料作製法を掲載しております。 試料作製. (図20)は様々なナイフの写真である。上はトリミング、または光学顕微鏡用(semi-thin section)で下が電子顕微鏡用(ultra-thin section)。, 意外と難しいのは培養細胞の超薄切片作製である。 電子染色 とは電子密度の高 い重金属を組織・ 細胞に結合させる ことで、酢酸ウラ ン及びクエン酸鉛 が普通用いられる。 前者は主に核酸、 リン脂質、植物細 胞壁等を良く染め る。後者は多くの 細胞内成分を染め る。また、酢酸ウ ラン染色の強調と しての作用もある。 染色法の実際は図 はじめに 免疫電子顕微鏡(免疫電顕)法は,抗原抗体反応を利用し て目的とする抗原の局在を,電子顕微鏡(電顕)下で識別可 能な標識でラベルした抗体を用いて検出する方法である.蛍 一般に粒子の半分より下が染色剤で覆われているほうが表面構造を鮮明に観察できる。全体に染色剤で覆われると上面と下面の構造が重なり解析が難しくなることもある(図3)。特に、両面とも規則正しい構造が含まれているとモワレにより全く関係ない模様が現れることもある。 ここでは主にこれら2つの方法について紹介する。, 精製したタンパク質あるいは複合体を高分解能で観察できる簡便な方法である。

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